ADP Cell lysis buffer, 35% Hydrogene peroxide Molarity for ADP ribosylation immunoblotting

ADP ribosylation immunoblotting은 일반적인 단백질 immunoblotting 보다 더 정교한 실험입니다. 정교한 실험인 만큼 cell lysis buffer가 일반적인 RIPA buffer 조성에서 차이가 있습니다. 이 글에서는 cell lysis buffer 조성, 35% hydrogen peroxide를 Molarity로 계산하는 방법에 대해서 설명을 하겠습니다. ADP ribosylation immunoblotting을 준비하시는 분들에게 도움이 되는 정보이길 바랍니다.

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본 내용의 참고문헌은 다음과 같습니다.

참고문헌, ADP ribosylation

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1. ADP Cell lysis buffer 조성과 농도

Buffer	Stock Concentration	Working Concentration	Volume (5ml)
SDS	10%	4%	2ml
HEPES	1M	50mM	0.25ml
NaCl	5M	150mM	0.15ml
MgCl2	1M	5mM	0.025ml
ddH2O	-	-	2.575ml
Benzonase	250U/ul	750U	per sample

 

2. Convert 35% Hydrogen Peroxide to Molarity

용액이 percentage로 되어 있을 때는 밀도를 생각해서 계산을 해야 합니다.

35% Hydrogen Peroxide Molarity

 

3. 2M Hydrogen peroxide working solution (Cell treatment stock solution)

Buffer	Stock Concentration	Volume (10ml)	Working Concentration
35% Hydrogen Peroxide	11.63M	1.72ml	2M
ddH2O	-	8.28ml	-
Total	-	10.0ml	-

 

4. 2mM or0.2mM Hydrogen peroxide working solution

Buffer	Stock Concentration	Volume (12ml)	Working Concentration
Hydrogen Peroxide #1	2M	12ul or 6ul	2mM or 1mM
Base medium	-	12ml	-
Hydrogen Peroxide #2	2M	1.2ul or 0.6ul	0.2mM or 0.1mM
Base medium		12ml

 

5. 세포 수집과 세포 용해

5-1. 세포 수집

• 3개의 그룹을 준비합니다. MEM 완전배지 (10% FBS, antibiotics)를 제거한 후, 따뜻한 DPBS로 세포 표면을 washing 합니다. [FBS는 실험결과에 영향을 줄 수 있으므로, DPBS를 이용해서 2번 washing 합니다.]

실험그룹

• Control - MEM base Medium or MEM complete medium (10% FBS, antibiotics)
• Experiment 1 - Hydrogen peroxide 2mM or 1mM into MEM complete medium
• Experiment 2 - Hydrogen peroxide 0.2mM or 0.02mM into MEM complete medium

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• Hydrogen peroxide 처치 후, 10분 동안 세포 배양기에 넣어 둡니다.

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• Point! (cell density가 높을 때)
  • hydrogen peroxide 처치 후에, 세포를 현미경에서 관찰합니다. 이때에, 세포가 세포접시 붙어 있다면, 배지를 조심스럽게 제거하고 ADP cell lysis buffer를 직접 세포 접시에 처리합니다. lysis buffer 양은 조건을 잡으면서 최적의 양을 계산해야 합니다.
  • lysis buffer를 여러 번 pipetting 하면서, 세포를 용해합니다.
  • 4℃, 13,000 rpm, 5 min 동안 원심 분리 후, 상청액을 새로운 e-tube에 옮깁니다.
  • 상청액을 snap-frozen후에, -20℃ 냉장고에 보관합니다.

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• 10분 후에 조심스럽게 세포 접시를 얼음 위에 올립니다.

세포 수집 방법 1

• 상청액을 제거합니다. DPBS 1ml을 넣은 후 세포 scraper로 세포를 모아서 15ml tube에 수집합니다.
• 1,000 rpm, 5분, 4℃ 원심분리기에서 세포를 모집합니다. 최대한 상청액을 제거합니다.

세포 수집 방법 2

(상황에 따라서 여러가지 방법을 해봅니다. 가장 최적화된 방법을 찾아가는 것이 실험입니다.) 상청액을 제거한 후, 세포 scraper로 모아서 e-tube에 수집한 후에, 13,000 rpm, 5분, 4℃ 원심분리기에서 세포를 모집합니다. 최대한 상청액을 제거합니다.

• ADP cell lysis buffer 100ul를 넣은 후 cell pellet을 부유합니다.

Cell lysis buffer의 양을 정하는 것이 정말 어려운 부분입니다. 이것은 세포의 크기, 세포 수 등 세포의 상태에 따라서 많이 변화합니다. 정확한 양이 있다기보다는 세포의 상태를 보아 가면서, cell lysis buffer의 양을 조절해야 합니다.

• [cell density가 높을 때] 각 tube에 ADP cell lysis buffer 1ml씩 분주합니다. pippetting으로 세포를 용해시킵니다.

• 각 tube에 250U benzonase를 3ul씩 넣은 후 섞어줍니다.
• 상온에서 5분 동안 방치합니다.
• 샘플들을 e-tube에 옮긴 후, 13,000 rpm, 4℃, 5분동안 원침합니다.
• 상청액을 새로운 e-tube에 옮깁니다.
• 다음과 과정을 진행하거나, snap-frozen 후에 -20℃ 냉동고 보관합니다.